这篇“samtools怎么使用”文章的知识点大部分人都不太理解，所以小编给大家总结了以下内容，内容详细，步骤清晰，具有一定的借鉴价值，希望大家阅读完这篇文章能有所收获，下面我们一起来看看这篇“samtools怎么使用”文章吧。
$samtoolsProgram: samtools (Tools for alignments in the SAM format) Version: 1.9 (using htslib 1.9) Usage: samtools <command> [options] Commands: -- Indexing dict create a sequence dictionary file faidx index/extract FASTA fqidx index/extract FASTQ index index alignment -- Editing calmd recalculate MD/NM tags and '=' bases fixmate fix mate information reheader replace BAM header targetcut cut fosmid regions (for fosmid pool only) addreplacerg adds or replaces RG tags markdup mark duplicates -- File operations collate shuffle and group alignments by name cat concatenate BAMs merge merge sorted alignments mpileup multi-way pileup sort sort alignment file split splits a file by read group quickcheck quickly check if SAM/BAM/CRAM file appears intact fastq converts a BAM to a FASTQ fasta converts a BAM to a FASTA -- Statistics bedcov read depth per BED region depth compute the depth flagstat simple stats idxstats BAM index stats phase phase heterozygotes stats generate stats (former bamcheck) -- Viewing flags explain BAM flags tview text alignment viewer view SAM<->BAM<->CRAM conversion depad convert padded BAM to unpadded BAM
从上面我们可以看到，大致我5类命令块：Indexing,Editing,File operations,Statistics,Viewing，下面我们来看看几个常用的命令
view命令的主要功能是：将sam文件与bam文件互换；然后对bam文件进行各种操作，比如数据的排序(sort)和提取(这些操作是对bam文件进行的，因而当输入为sam文件的时候，不能进行该操作)；最后将排序或提取得到的数据输出为bam或sam（默认的）格式。
bam文件优点：bam文件为二进制文件，占用的磁盘空间比sam文本文件小；利用bam二进制文件的运算速度快。
view命令中，对sam文件头部（序列ID）的输入(-t或-T）和输出(-h)是单独的一些参数来控制的。
Usage: samtools view [options] | [region1 [...]]
下面的view命令的部分参数
默认情况下不加 region，则是输出所有的 region.options:
-b output BAM # 该参数设置输出 BAM 格式，默认下输出是 SAM 格式文件-h print header for the SAM output # 默认下输出的 sam 格式文件不带 header，该参数设定输出sam文件时带 header 信息 -H print SAM header only (no alignments) # 仅仅输出文件的头文件-S input is SAM # 默认下输入是 BAM 文件，若是输入是 SAM 文件，则最好加该参数，否则有时候会报错。 -u uncompressed BAM output (force -b) # 该参数的使用需要有-b参数，能节约时间，但是需要更多磁盘空间。 -c print only the count of matching records# 仅输出匹配的统计记录 -L FILE only include reads overlapping this BED FILE [null] # 仅包括和bed文件存在overlap的reads-o FILE output file name [stdout] # 输出文件的名称-F INT only include reads with none of the FLAGS in INT present [0] # 过滤flag，仅输出指定FLAG值的序列-q INT only include reads with mapping quality >= INT [0] # 比对的最低质量值，一般认为20就为unique比对了，可以结合上述-bF参数使用使用提取特定的比对结果-@ Number of additional threads to use [0]# 指使用的线程数
下面来看几个例子，如果想要比较直观的结果，可以用软件自带的测试数据，在example文件夹中
# 将sam文件转换成bam文件samtools view -bS abc.sam > abc.bam# BAM转换为SAMsamtools view -h -o out.sam out.bam# 提取比对到参考序列上的比对结果samtools view -bF 4 abc.bam > abc.F.bam# 提取paired reads中两条reads都比对到参考序列上的比对结果，只需要把两个4+8的值12作为过滤参数即可samtools view -bF 12 abc.bam > abc.F12.bam# 提取没有比对到参考序列上的比对结果samtools view -bf 4 abc.bam > abc.f.bam# 提取bam文件中比对到caffold1上的比对结果，并保存到sam文件格式samtools view abc.bam scaffold1 > scaffold1.sam# 提取scaffold1上能比对到30k到100k区域的比对结果samtools view abc.bam scaffold1:30000-100000 $gt; scaffold1_30k-100k.sam# 根据fasta文件，将 header 加入到 sam 或 bam 文件中samtools view -T genome.fasta -h scaffold1.sam > scaffold1.h.sam
sort对bam文件进行排序。
Usage: samtools sort [option] <in.bam> -o <out.prefix> -n Sort by read name#设定排序方式按short reads的ID排序。默认下是按序列在fasta文件中的顺序（即header）和序列从左往右的位点排序。-m INT Set maximum memory per thread; suffix K/M/G recognized [768M]# 设置每个线程的最大内存，单位可以是K/M/G，默认是 768M。对于处理大数据时，如果内存够用，则设置大点的值，以节约时间。-t TAG Sort by value of TAG. Uses position as secondary index (or read name if -n is set)# 按照TAG值排序-o FILE Write final output to FILE rather than standard output # 输出到文件中，加文件名
例子：
# tmp.bam 按照序列位置排序，并将结果输出到tmp.sort.bam samtools sort -n tmp.bam -o tmp.sort.bam samtools view tmp.sort.bam
merge将多个已经sort了的bam文件融合成一个bam文件。融合后的文件不需要则是已经sort过了的。而cat命令不需要将bam文件进行sort。
Usage: samtools merge [-nurlf] [-h inh.sam] [-b <bamlist.fofn>] <out.bam> <in1.bam> [<in2.bam> ... <inN.bam>] Options: -n Input files are sorted by read name# 输入文件是经过sort -n的 -t TAG Input files are sorted by TAG value# 输入文件是经过sort -t的 -r Attach RG tag (inferred from file names)# 添加上RG标签 -u Uncompressed BAM output# 输出未压缩的bam -f Overwrite the output BAM if exist# 覆盖已经存在的bam -1 Compress level 1# 1倍压缩 -l INT Compression level, from 0 to 9 [-1]# 指定压缩倍数 -R STR Merge file in the specified region STR [all] -h FILE Copy the header in FILE to <out.bam> [in1.bam]
$samtools catUsage: samtools cat [options] <in1.bam> [... <inN.bam>] samtools cat [options] <in1.cram> [... <inN.cram>] Options: -b FILE list of input BAM/CRAM file names, one per line -h FILE copy the header from FILE [default is 1st input file] -o FILE output BAM/CRAM
对排序后的序列建立索引，并输出为bai文件，用于快速随机处理。在很多情况下，特别是需要显示比对序列的时候，bai文件是必不可少的，例如之后的tview命令。
Usage: samtools index <in.bam> [out.index]samtools index abc.sort.bam
对fasta文件建立索引,生成的索引文件以.fai后缀结尾。该命令也能依据索引文件快速提取fasta文件中的某一条（子）序列
Usage: samtools faidx <file.fa|file.fa.gz> [<reg> [...]]samtools faidx <file.fa|file.fa.gz> [<reg> [...]]
如对基因组文件建立索引
samtools faidx genome.fasta# 生成了索引文件genome.fasta.fai,是一个文本文件，分成了5列。第一列是子序列的名称；第二列是子序列的长度；个人认为“第三列是序列所在的位置”，因为该数字从上往下逐渐变大，最后的数字是genome.fasta文件的大小；第4和5列不知是啥意思。于是通过此文件，可以定位子序列在fasta文件在磁盘上的存放位置，直接快速调出子序列。 # 由于有索引文件，可以使用以下命令很快从基因组中提取到fasta格式的子序列samtools faidx genome.fasta scffold_10 > scaffold_10.fasta
tview能直观的显示出reads比对基因组的情况，和基因组浏览器有点类似。可视化一般用IGV比较好，不建议用tview
Usage: samtools tview <aln.bam> [ref.fasta]
当给出参考基因组的时候，会在第一排显示参考基因组的序列，否则，第一排全用N表示。
按下 g ，则提示输入要到达基因组的某一个位点。例子“scaffold_10:1000"表示到达第10号scaffold的第1000个碱基位点处。
使用H(左）J（上）K（下）L（右）移动显示界面。大写字母移动快，小写字母移动慢。
使用空格建向左快速移动（和 L 类似），使用Backspace键向左快速移动（和 H 类似）。
Ctrl+H 向左移动1kb碱基距离； Ctrl+L 向右移动1kb碱基距离
可以用颜色标注比对质量，碱基质量，核苷酸等。30～40的碱基质量或比对质量使用白色表示；
20～30黄色；10～20绿色；0～10蓝色。
使用点号‘.‘切换显示碱基和点号；使用r切换显示read name等
还有很多其它的使用说明，具体按 ？ 键来查看。
给出BAM文件的比对结果，并输出比对统计结果。除了-@参数指定线程，没有其他的参数
Usage: samtools flagstat [options] <in.bam> samtools flagstat tmp.bam 20000 + 0 in total (QC-passed reads + QC-failed reads)# 总共的reads数0 + 0 secondary 0 + 0 supplementary 0 + 0 duplicates 18995 + 0 mapped (94.98% : N/A)# 总体上reads的匹配率20000 + 0 paired in sequencing# 有多少reads是属于paired reads10000 + 0 read1# reads1中的reads数10000 + 0 read2# reads2中的reads数18332 + 0 properly paired (91.66% : N/A)# 完美匹配的reads数和比例：比对到同一条参考序列，并且两条reads之间的距离符合设置的阈值18416 + 0 with itself and mate mapped# paired reads中两条都比对到参考序列上的reads数579 + 0 singletons (2.90% : N/A)# 单独一条匹配到参考序列上的reads数，和上一个相加，则是总的匹配上的reads数。0 + 0 with mate mapped to a different chr# paired reads中两条分别比对到两条不同的参考序列的reads数0 + 0 with mate mapped to a different chr (mapQ>=5)# 同上一个，只是其中比对质量>=5的reads的数量
得到每个碱基位点的测序深度，并输出到标准输出。输入的bam文件必须先做samtools index
Usage: samtools depth [-r reg] [-q baseQthres] [-Q mapQthres] [-b in.bed] <in1.bam> [...] -r <chr:from-to> region# 后面跟染色体号（region）-a output all positions (including zero depth)# 输入所有位置的序列，包括测序深度为0的-q <int> base quality threshold [0]# 碱基质量阈值-Q <int> mapping quality threshold [0]# 比对的质量阈值
举例：
samtools depth tmp.index.bam > tmp.depth.bam
reheader 替换bam文件的头
$ samtools reheader <in.header.sam> <in.bam>
idxstats 统计一个表格，4列，分别为”序列名，序列长度，比对上的reads数，unmapped reads number”。第4列应该是paired reads中有一端能匹配到该scaffold上，而另外一端不匹配到任何scaffolds上的reads数。
samtools idxstats <aln.bam>
有时候，我们需要提取出比对到一段参考序列的reads，进行小范围的分析，以利于debug等。这时需要将bam或sam文件转换为fastq格式。
该网站提供了一个bam转换为fastq的程序：http://www.hudsonalpha.org/gsl/information/software/bam2fastq
wget http://www.hudsonalpha.org/gsl/static/software/bam2fastq-1.1.0.tgztar zxf bam2fastq-1.1.0.tgz cd bam2fastq-1.1.0make ./bam2fastq <in.bam>
samtools还有个非常重要的命令mpileup，以前为pileup。该命令用于生成bcf文件，再使用bcftools进行SNP和Indel的分析。bcftools是samtool中附带的软件，在samtools的安装文件夹中可以找到。
用法：
Usage: samtools mpileup [-EBug] [-C capQcoef] [-r reg] [-f in.fa] [-l list] [-M capMapQ] [-Q minBaseQ] [-q minMapQ] in.bam [in2.bam [...]]
最常用的参数有2：
-f 来输入有索引文件的fasta参考序列；
-g 输出到bcf格式。用法和最简单的例子如下
samtools mpileup -f genome.fasta abc.bam > abc.txt samtools mpileup -gSDf genome.fasta abc.bam > abc.bcf samtools mpileup -guSDf genome.fasta abc.bam | bcftools view -cvNg - > abc.vcf
mpileup不使用-u或-g参数时，则不生成二进制的bcf文件，而生成一个文本文件(输出到标准输出)。该文本文件统计了参考序列中每个碱基位点的比对情况；该文件每一行代表了参考序列中某一个碱基位点的比对结果。比如：
scaffold_1 2841 A 11 ,,,...,.... BHIGDGIJ?FF scaffold_1 2842 C 12 ,$,,...,....^I. CFGEGEGGCFF+ scaffold_1 2843 G 11 ,,...,..... FDDDDCD?DD+ scaffold_1 2844 G 11 ,,...,..... FA?AAAA<AA+ scaffold_1 2845 G 11 ,,...,..... F656666166* scaffold_1 2846 A 11 ,,...,..... (1.1111)11* scaffold_1 2847 A 11 ,,+9acggtgaag.+9ACGGTGAAT.+9ACGGTGAAG.+9ACGGTGAAG,+9acggtgaag.+9ACGGTGAAG.+9ACGGTGAAG.+9ACGGTGAAG.+9ACGGTGAAG.+9ACGGTGAAG %.+....-..) scaffold_1 2848 N 11 agGGGgGGGGG !!$!!!!!!!! scaffold_1 2849 A 11 c$,...,..... !0000000000scaffold_1 2850 A 10 ,...,..... 353333333
mpileup生成的结果包含6行：参考序列名；位置；参考碱基；比对上的reads数；比对情况；比对上的碱基的质量。其中第5列比较复杂,解释如下：
1 ‘.’代表与参考序列正链匹配。
2 ‘,’代表与参考序列负链匹配。
3 ‘ATCGN’代表在正链上的不匹配。
4 ‘atcgn’代表在负链上的不匹配。
5 ‘*’代表模糊碱基
6 ‘’代表匹配的碱基是一个read的开始；’‘后面紧跟的ascii码减去33代表比对质量；这两个符号修饰的是后面的碱基，其后紧跟的碱基(.,ATCGatcgNn)代表该read的第一个碱基。
7 ‘$’代表一个read的结束，该符号修饰的是其前面的碱基。
8 正则式’+[0-9]+[ACGTNacgtn]+’代表在该位点后插入的碱基；比如上例中在scaffold_1的2847后插入了9个长度的碱基acggtgaag。表明此处极可能是indel。
9 正则式’-[0-9]+[ACGTNacgtn]+’代表在该位点后缺失的碱基；
NGS上机测序前需要进行PCR一步，使一个模板扩增出一簇，从而在上机测序的时候表现出为1个点，即一个reads。若一个模板扩增出了多簇，结 果得到了多个reads，这些reads的坐标(coordinates)是相近的。在进行了reads比对后需要将这些由PCR duplicates获得的reads去掉，并只保留最高比对质量的read。使用rmdup命令即可完成.
Usage: samtools rmdup [-sS] -s rmdup for SE reads# 对single-end reads。默认情况下，只对paired-end reads-S treat PE reads as SE in rmdup (force -s)# 将Paired-end reads作为single-end reads处理。
以上就是关于“samtools怎么使用”这篇文章的内容，相信大家都有了一定的了解，希望小编分享的内容对大家有帮助，若想了解更多相关的知识内容，请关注亿速云行业资讯频道。
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