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pacbio 三代全长转录组数据分析流程 Iso-Seq 3
Iso-Seq的建库方案有如下三类：
整个库都是一个样品的全长转录组，不需要加barcode区分样品
不同样品的全长转录组，加上不同barcode ，可以放在一起进行建库测序
一些靶向获得的部分基因也可以进行全长转录组的测序
Iso-Seq3 进行全长转录组的分析
1 ccs(Circular Consensus Calling)
ccs 获取一致性的序列，要求每一条测序的reads至少有一端含有引物序列。
ccs test.subreads.bam ccs.bam --noPolish --minPasses 1
2 测序引物和barcode的去除
这一步是采用lima 来完成的，这个软件也是官方最新开发出来的程序，速度和准确度都较以往的算法有了很大的提升。还能够基于barcode序列区分不同的样品，
lima ccs.bam barcoded_primers.fasta demux.ccs.bam --isoseq --no-pbi
3 聚类(cluster)
聚类采用IsoSeq3 软件来完成，这一步会首先将ployA尾巴去除掉，并将连环结构去除掉，再对相似的序列进行聚类，最好形成全长的reads。
isoseq3 cluster demux.primer_5p--primer_3p.bam unpolished.bam --verbose
4 抛光(polish)
这一步主要是将聚类的转录本，合并成一个完整的一致性序列。
isoseq3 polish -j 16 unpolished.bam test.subreads.bam polished.bam
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